酶免疫斑点试验 检查抗体

　　【原理】

　　将滤纸或纤维素膜作为固相载体交联或吸附抗原后、再分别与未知抗体和酶标第二抗体反应，经酶催化底物而显色，从而检测相应抗体。

　　【试剂】

　　（1）硝酸纤维膜，孔径为 0．3μm。

　　（2）2% BSA（蒸馏水配制）。

　　（3）0．01mol/L pH 7．2 PBS。

　　（4）抗人 Ig-HRP 结合物。

　　（5）二氨基联苯胺（DAB）底物溶液：

　　将 30mgDAB 溶于 0．05mol/L pH 7．4 Tris-HCl缓冲液 100mL 中，过滤，4℃ 暗处贮存，临用时加 3% H2O2，最终浓度为 0．05% 。

　　【方法】

　　1）微孔滤膜切成 4mm ×50mm 的长条，用铅笔标明位置，点距 4mm，浸于 PBS中 15min，用滤纸吸干。

　　2）在滤膜相应位置点精子抗原 2μL，4℃ 作用 30min，吸干，PBS漂洗 3次。

　　3）浸于 2% BSA 溶液中，4℃ 封闭 15min，洗 3次，吸干。

　　4）1∶4待检血清点样 0．5μL，4℃ 15min，洗 3次，吸干。

　　5）浸于酶标二抗溶液（1∶1 500）中，4℃ 15min，洗 4次，每次 5min。

　　6）DAB-H2O2底物显色 10min，PBS洗 0．5min。

　　【结果】

　　呈现褐色斑点者为阳性，无色或微黄色为阴性。