一、定时曝光显微摄影术 （一）背景 利用连续显微摄影技术，精子游动"痕迹"或"轨迹"可显示在放大的照相负片上。有关这方面的最初研究将测定人类精子的运动速度与肉眼判定的精子运动主观速率相联系。这些早期研究是通过测量游动精子在 1s曝光时间条件下所留下的轨迹长度来测算其速度的。进一步研究则产生另一种推算精子速度的简单方法，即根据游动精子轨迹在放大的负片上穿过其对角线的频率来计算。后来的一个研究就是应用"穿对角线"的分析方法显示在25～ 37℃ 之间人类精子的速度可增加 60% ～ 100% 。 除了精子运动速度，人们对其运动的类型也越来越感兴趣，故建立了称之为定时曝光显微摄影技术的研究方法。更适合于临床常规应用，随后又与 ALH 测定结合起来（关于人类精子动力学的显微电影摄像研究对 ALH 作了最初描述）。目前已用快速摄影代替了电影胶卷。尽管快速摄影所得到的影像比电影胶卷投影要小得多，但却不必冲洗胶卷。 （二）运动特征 对人类精子运动进行定时曝光显微摄影术分析能够可靠测量 VSL 与 ALH。但是 BCF值却不能利用定时曝光显微摄影术影像进行可靠的确定。因为对 BCF 的测量，只能在具有明显的头部侧向位移的轨迹上进行（有时候这类精子被称为偏离精子）。在狭窄的轨迹上，若精子头部的图像持续重叠着，以致精子的多次摆动难以识别（故有时称之为旋转精子）。因为这类精子的摆动频率分布可能相同，也可能不同。因此，仅仅根据这些具有充分宽度轨迹的精子来确定 BCF 值在统计学上是不合理的。 由于精子头部实际上的三维轨迹是一个椭圆横断面的螺旋形，很可能"旋转"与"偏移"轨迹仅仅代表这些看上去垂直于椭圆的最大轴或最小轴的轨迹。因此，"旋转"和"偏移"实际上很可能并没有什么质的区别，因为他们未必反映不同的运动类型。 （三）技术方面 尽管大多数应用定时曝光显微摄影术技术的研究人员采用的曝光时间均为 1s，但也有人用 0.5～ 2.0s。由于游动最快的精子在观察期内很有可能离开镜检视野，从而其运动轨迹会被截断。对于这些细胞就无法测量其运动速度。因此在这种情况下由于排除了高速游动的精子就会导致速度测量中的系统偏差。同时还有一种类似的情况是观察期内的其他的活动精子同样存在进入或离开镜检视野的可能性。然而仅对穿越视野边缘的精子轨迹计数，则测定活动精子百分比时就会把"出入"视野的因素混入其中，从而无法校正精子活动速度分布。因此，在所有研究中必须采用相同的曝光时间，只有这样，这些研究的资料才有可比性。在人类精子动力学的定时曝光显微摄影术研究中，已被接受的标准曝光时间是 1s。 在分析时，幻灯片通常是投影到一张白纸上（半自动化方法则投射到计数表的活动表面上）可以直接测量，也可先进行追踪，然后再测量。若是在一次成像的照片上直接测量，则其轨迹影像大大小于胶片的投影，故精确度较低，特别是测量 ALH 时。 VSL值是通过用尺测量定时曝光显微摄影术胶片或一次成像照片上精子活动轨迹两端的直线距离而得，但 ALH 值可用多种方法测量。通常是在精子轨迹上取 2～ 3个点，测量其宽度，然后将所得之值平均，即得轨迹均值。通常用一把尺即可进行测量，有时再借助若干平行尺，或者将具有不同直径的圆环模型放在上面进行测量。 （四）半自动化方法 分析定时曝光显微摄影术图像的半自动化系统已经建立。该系统能快速准确地测量轨迹的长度和宽度，通常还能同时计算所分析的精子群体活动轨迹的相应参数的均值。半自动图像分析方法的一个优点在于轨迹宽度是结合总轨迹宽度的平均值来计的，即将轨迹总面积投影除以肉眼估计的平均轨迹长度即得，一次成像照片也可用此系统来分析，并可使精确度明显提高。
（一）背景 1978年，Malker描述了另外一种应用相差显微镜并结合频闪观测器的照明装置评价人类精子活动力的显微摄影法。这种多次曝光显微摄影法可显示在 1/6间隔内精子序贯位置的摄影记录，图像中"六环链"被用以区分活动精子与非活动精子并可用以计算各个活动精子的运动速度。由于该方法是使用 Malker池进行测定的，故精子的浓度也可测定。 从上述系统的有效性看，对于确定人类精液精子速度而言，1s的测量期限被认为是适当的。 多次曝光显微摄影法系统已为许多研究所采用，该系统现已发展成为一种半自动化方法，其中某些系统已有市售。快速显微摄影技术则使这一系统更趋完善。 （二）运动特征 在精液分析方面，多次曝光显微摄影法能提供精子浓度值（但如前所述受到 Malker池的限制）与活动精子的百分比。而就精子运动特征而言，通过测量六环链中精子头部的首尾位置之间的直线距离只能得到 VSL 值。利用六环链中两相邻精子头部的直线距离，则仅能得到 VAP 的近似值。遗憾的是多次曝光显微摄影法对于测量 VCL、ALH 和 BCF，既不能提供充分积分的轨迹，也不能提供快速抽样的轨迹。 鉴于 ALH 指标的明显的生理和临床意义，定时曝光显微摄影显然是一种更好的方法。 三、显微电影摄像术 （一）背景 该法用于研究精子活动力几乎已有 40 年历史。有关的经典文献报道 van Duijn 和 PhiUips分别应用低速（16张 /s）和高速（500张 /s）显微电影摄像术开始进行人类精子动力学的定性分析，而 David等人报道应用中等速度（50张 /s）显微电影摄影术研究人类精子运动特征，这些工作基本上构成了以后所有关于人类精子运动特征的研究工作的基础。 （二）运动特征 在根据电影胶片（或录像带）再现精子运动轨迹时，究竟应该用精子头-中段结合部还是精子头质心依然存在着争论。但是大多数的研究工作均应用了精子头质心。看来这显然是最为适合的方法，特别是当应用计数图像分析技术根据电影胶片和录像带来重显精子运动轨迹时。尽管由显微电影摄像术产生的空间影像和时间消退均较与现有的显微录像技术产生的要好，由于其高额的操作费用，显微电影摄像技术已或多或少为显微摄像技术所取代。 四、显微摄像技术 （一）背景 20世纪 80年代初，Katz和 Qverstreet首次报道应用显微摄像术评价人类精子活动力。这种方法依靠手动放映装置分析录像带，从而得出活动精子的百分比和VSL 值。应用此方法，可以同时对精子个体进行形态学评价，并已证明：① 同一精子样品中，与形态正常的精子相比，形态异常的精子更有可能是无活动力或活动力弱的精子；② 与有生育力男子相比，不育男子射出的精液中，形态学正常的精子中出现活动精子的概率相对较低，且游动也更慢。 （二）半自动化与自动化方法 有关应用电脑辅助的半自动化录像追踪技术分析活动精子的研究已有报道。但半自动化方法，更多的是用于根据手工方法再现的精子轨迹计算精子运动特征。尽管用于评价人类精子形态学的自动化方法已经建立，但尚未能与精子活动力自动化分析系统结合起来以提供"形态-活动力评估最近，出现了很多对录像信号进行计数图像分析的自动化系统，这些信号是由照相机或摄像机记录下来的。有人曾经预言摄像-电脑系统将常规用于精子活动力评估，现在这一预言确实已成为现实。这些自动化方法基本上使半自动化方法多少有点多余。自然半自动化系统在尚未拥有昂贵的自动分析仪的实验室里仍有其用武之地。 （三）技术方面 1.电视标准 关于录像的一个混淆因素是全世界有多种不同电视广播和录像标准。这些标准可分为三大组，各组间又有其微小差异。如美国国家电视标准委员会（，NTSC）系统拥有 525条线路，在 60Hz以 2∶1隔行扫描，图像播出速率为每秒 30个画面。逐行倒相制（phasealternatingline，PAL）和顺序传送色彩与存储制（sequentialcouleuravecmemoire，SECAM）两系统均有 625条线路，50 Hz扫描速度为每秒提供25个画面。 尽管 PAL 和 SECAM 在彩色方法或彩色讯号编码上有差别，使其与彩色电视标准不兼容，但当仅用单色图像（以进行计数图像分析）时，则可认为两者基本相同的。目前 NTSC 标准已在加拿大、智利、韩国、中国台湾、美国及其他一些国家和地区中使用。而使用 PAL 标准的国家除中国内地之外尚有阿根廷、澳大利亚、奥地利、比利时、巴西、丹麦、芬兰、德国（前西德地区）、中国香港、冰岛、印度、以色列、朝鲜、卢森堡（德语区）、荷兰、新西兰、挪威、巴基斯坦、新加坡、南非、西班牙、瑞典、土耳其、阿拉伯联合王国、英国、南斯拉夫；使用 SECAM系统的国家则有埃及、法国、德国（前东德地区）、希腊、伊朗、伊拉克、卢森堡（法语区）、波兰和独联体各国。
2.录像标准 同样存在数种不同的 VCR 标准。索尼公司一直负责 U-M（U-Matic）和 B 系统，但前者基本上限于广播和严格的研究应用，而后者广泛地应用于家庭中。新近又研制了一种超 B 改良系统（superbetavariant）。B 标准 VCR 有三种速度（速度Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），几乎所有机器均能以这三种速度播放录像，通常仅专业性机器以 B-Ⅰ速度进行录像，家用机器则常常仅以 B-Ⅱ和B-Ⅲ速度录像。在某些录像机上可应用已问世的新 B-IS。但这类磁带只能在那些对新标准兼容的机器上播放。Video8及其兼容 VHS或 VHS-C 已无多大优越性，因为这些标准基本上限于家用录像机。VHS系统也具有符合 NTSC 标准的多种播放速度：在 PAL 制式国家为标准播放速度和长时播放速度。在 SECAM 国家还有第 3个速度，称之为延伸播放速度或超长播放速度。一种新的高分辨率超-VHS（VHS-S）标准也已经问世，但价格昂贵，所有 VCR 系统都按照其制造国电视标准运行，而且必须与一种适当的摄像机联合使用。应该使用最高速度进行图像分析，从而获得最高质量的图像以进行数码化处理，即用 B-Ⅰ、B-Ⅱ或 SP型 VHS。为了尽量减少反复播放过程中磁带疲劳磨损和过度伸展，应该使用基底最厚的录像带，如 PL-250 或 VHS60min带（在 NTSC 地区是 T-60，在 PAL/SECAM 地区则为 E-60）。 3.高速系统 已有两种高频画面系统问世，一是 MHS-200系统（日本东京 NAC 联合公司制造），联合应用高敏感性和高分辨率照相机，其操作图像频率高达每秒 200 次。另一系统为 CTS-200，图像频率亦可高达每秒 200Hz（美国加州 SantaRosa运动分析公司制造） 4.校正和样本识别 为了校正和识别样本，需用时 /日显示器和文本显示器。这些仪器能在记录之前把文本和数字特征转换成摄像机的输出讯号。作为研究目的，宜使用 For-A，VTG-33时 /日显示器（日本东京 For-A 公司），而作为常规应用，则更为廉价的松下实业公司的产品能完全满足要求。我们已经应用一种文本显示器（美国加州 生产的 型），该型号的装置允许使用自由文本，而不仅是提供时间 /日期信息。 5.光学显微镜 为了便于手工轨迹再造，可应用正低（PL）和负高（NH）相差显微镜和 Nomarski光学显微镜。PL 相差光学显微镜最为常用，对于视觉分析已完全足够。但有些学者发现 NH 相差显微镜可提供更好图像以进行图像数码分析，而且应该用来作各种记录以供分析（采用机械视频方法）。Nomarski显微镜可提供一个准三维图像在分析鞭毛运动时特别有用。其缺点是需要用更强的光源和（或）更敏感的录像照相机。 当制作录像记录时，如同照片或电影显微摄像那样，建议始终尽可能地使用最低倍的物镜，因为这样可拍出亮度更高、焦距更深的图像。倘若分辨率转换不成问题，通常最好使用较低倍的物镜，并结合直接放大（利用照相机目镜）。虽然这并未去除亮度不足的问题，却能提供一个较大的图像，而又不失焦距的深度。 （四）运动特征 通过录像记录分析精子活动力和运动特征，从最初的 Katz和 "牛眼法开始已经走过了一段很长的路程。对于活动的精子，现可通过画面追踪来重现其在一定时间内的运动。分析手工重建轨迹的方法，与对显微电影摄影图像进行分析的手工或半自动化方法基本相同。计算机化精子活动力分析系统（见第五节）可自动再现精子活动轨迹并可获得其运动特征。 曲线轨迹长度可用一个曲线表或地图尺进行手工测量。从轨迹的两端开始，所得的两个值进行平均，曲线表也能用来测量肉眼可见的整个轨迹中线或平均轨迹的长度。直线轨迹长度可用直尺测量轨迹的起点和终点之间的距离计算出来。ALH 的测量既可用平行尺（通常沿着再造轨迹取三点即可），也可通过以下方法获得：即精子头部偏离平均轨迹的顶端一侧连至与该顶点相邻的偏向平均线的距离。这一测定可以在重建轨迹后在每个波上重复进行。然后将测得值平均即获得 ALH 之均值或取其最高测量值作为 ALH 最大值。如果ALH 值是通过测量精子头部侧向运动顶点与平均轨迹之间的距离获得的，那么其平均值或最大值乘以 2就代表整个轨迹的宽度。根据曲线轨迹与单位时间穿过平均轨迹的次数即可计算 BCF。至于平均轨迹则可用多种方法获得包括几何连接法和五点平均拟合法 |
