精子抗原与第一抗体（待检血清）反应后，再与辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG（Fab?）2［HRP-羊抗人 IgG（Fab?）2］片段结合，在酶催化底物的作用下，进行显色反应，得到具有一定电子密度的有色产物，从而可间接判断待检血清中是否存在相应的抗体。

　　【试剂】

　　（1）0.01mol/L pH 7.4 磷酸缓冲液（PBS）。

　　（2）HRP-羊抗人 IgG（Fab?）2。

　　（3）底物溶液：3，3'-二氨基联苯胺盐酸盐（DAB）5mg，先用 0.1mL 二甲亚砜（分析纯）助溶，再加 PBS 5mL，3% H2O20.05mL，临用前配制。

　　（4）甲醇（分析纯）。

　　【方法】

　　（1）取丈夫新鲜精液，液化后离心去上清。

　　（2）沉淀用 PBS离心洗 3次，最后配成 5×104/mL 精子悬液。

　　（3）精子悬液涂片，一式两份，室温自然干燥。

　　（4）甲醇固定 10min。

　　（5）分别加夫妇血清、已知阳性血清和阴性对照血清（处女 AB 型血清），37℃ 湿盒30min。

　　（6）PBS洗 3次，晾干。

　　（7）加 1∶1000稀释的 HRP-羊抗人 IgG（Fab?）237℃ 湿盒 30min。

　　（8）PBS洗 3次。

　　（9）加底物溶液，37℃ 湿盒反应 15min。

　　（10）PBS洗 3次，吹干镜检。

　　【结果判断】

　　油镜下观察，精子呈棕黄色为阳性，精子不着色或极淡黄色为阴性。