精子细胞毒试验

　　抗精子抗体与精子结合后，在补体参与下，可导致精子制动和死亡，利用台盼蓝或伊红Y 等染料使死精子染色，间接验证血清或分泌液中是否有制动精子的抗体存在。

　　（一）台盼蓝染色法

　　【准备】

　　（1）待检血清的分离和灭活补体。

　　（2）AB 血型人血清（补体）制备。

　　（3）2% 台盼蓝液配制（用蒸馏水）。

　　（4）台盼蓝-生理盐水溶液配制：取适量生理盐水，加等体积 2% 台盼蓝水溶液，混匀即可。

　　（5）配制 0.01 mol/L，pH 7.4 PBS 溶液。

　　【方法】

　　（1）取正常新鲜精液［精子浓度为（40～ 100）× 106/mL］用 pH 7.4 PBS作 1∶10 稀释，以500r/min 30min离心洗涤一次，弃去上清，沉渣用 PBS调整精子浓度为 100× 106/mL 的精子悬液。

　　（2）在小试管内加入 1滴待检血清，1滴精子悬液和 2滴补体血清。置 37℃ 孵育，并于30min、60min分别追加 2滴补体血清，直至 90min后加入 1滴台盼蓝生理盐水溶液，继续孵育 60min，取出小试管，以 500 r/min，30min离心，弃去上清，将沉渣涂片，待干燥后镜下观察。以阴性血清作对照组，以同样条件和方法处理。

　　（3）计数：对照组：记录数至 100个无染色精子（活精子）时所需的总精子数（含 100个无染色精子加一定数量染色的死精子）。实验组：记录对照组相应的总精子数，把其中所含的无染色精子（活精子）数作 X。将 100- X 所得的数目，即为被检血致死的精子数，这个数目称为精子毒性指数（STI）。

　　【判断】

　　（1）STI>25时，P≤0.01，判为阳性。

　　（2）STI在 15～ 20之间，判为可疑。

　　（3）STI<15时，判为阴性。

　　本法所得阳性率与精子制动试验的阳性率较为一致。

　　（二）伊红 Y 染色法

　　【准备】

　　（1）用蒸馏水配制 4% 伊红 Y 染液。

　　（2）配制 0.01mol/L，pH 7.4 PBS溶液。

　　【方法】

　　（1）取正常新鲜精液（精子浓度宜大于：60×106/mL），用 pH 7.4 的 PBS洗涤 3次，调整精子浓度为 10×107/mL。

　　（2）取精子悬液 16μL，移置载玻板的漆孔内，分别设 2个测定和对照孔，另取待检血清20μL，补体血清 4μL 加入测定孔内，对照孔只加待测血清不加补体，充分混匀。

　　（3）把玻板移入湿盒内，在 37℃ 孵育 30min，每孔加 4% 伊红 Y 4μL，加上盖玻片使其作用 2min，进行镜检。

　　【判断】

　　由于活精子不着色，死精子着染为红色，计算 200个精子中，死精子所占的百分数，减去对照组死精子的百分数，即为抗体杀灭精子的百分率。以杀灭精子≥10% 以上者为阳性。