酶联免疫吸附试验

　　【原理】

　　本法用带正电荷的聚氯乙烯（PVC）微量反应板，将精子抗原吸附到聚氯乙烯固相载体表面，其固相抗原可与待测标本中抗精子抗体（As-Ab）结合，并与加入的抗人 IgG 酶结合物起反应，形成抗原抗体酶结合物，最终在酶底物作用下而显色。

　　【试剂】

　　（1）包被液：0.01mol/L pH 9.6碳酸钠缓冲液：

　　Na2CO3 1.06 g

　　NaHCO3 0.84 g}加双蒸水至 1 000mL。

　　（2）缓冲液：0.01mol/L pH 7.4 PBS：

　　【方法】

　　（1）精子抗原制备：筛选收集精液常规检查正常的精液，用生理盐水反复离心洗涤，尽可能除去精浆，经超声波超声粉碎，10～ 15min 高速离心，吸上清，测定上清液蛋白浓度，将蛋白浓度稀释为 3.5～ 5.0μg/mL，为精子抗原溶液。

　　（2）反应板包被抗原：将人精子抗原稀释成 3.5～ 5μg/mL，包被液加到聚氯乙烯微量测定板内，每孔 100μL，置 4℃ 冰箱过夜。

　　（3）封闭处理：次日早晨，倾去抗原溶液，用洗涤 PBS洗 3次，每次 5min，每次洗涤后都要将板在纸上拍干，再加入 1% 的聚乙烯醇溶液 200μL封闭，置室温 1h后同上法洗涤。

　　（4）加待测样品：样品用 PBS稀释 100倍，每孔加入 100μL，同时加 As-Ab血清及正常处女血清作分别阳性和阴性对照，置 37℃ 温育 1h，同上法洗涤。

　　（5）加酶结合物：HRP-Protein A 以 1∶640稀释，每孔加入 100μL，置室温 1h，同上洗涤。

　　（6）酶反应：加新鲜配制的 OPD 底物溶液，每孔加入 50μL，置室温暗处 10min，再加10% H2SO4终止液每孔 50μL。

　　（7）结果判定：用酶标测定仪 490μm测其 OD 值，OD 值≥2.0时为阳性。